服务介绍:
细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质,最终获得高纯RNA产物的过程。再在逆转录酶的催化下,随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA (complementary DNA,cDNA)。
实验流程:
取材-RNA提取-测浓度-逆转录成cDNA
其中mRNA、lncRNA、circRNA为普通逆转录;
miRNA采取特异性逆转录(需提供基因名称和种属,方便设计引物用于特异性逆转录 ),默认做茎环法的逆转录,如需做加尾法逆转录请特别备注说明。
样本收集:
1、细胞板贴壁细胞收集:
细胞弃培养上清,预冷PBS轻柔洗涤保证完全去除培养基。加少量预冷的PBS用细胞刮刀将细胞收集于冻存管,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。
2、细胞团块收集:
细胞团块加1ml PBS重悬(注意不要过于剧烈造成细胞破裂),4℃ 1000rpm离心5分钟,弃上清,重复3次,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。
3、悬浮细胞收集:
将培养完成的细胞,转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。
裂解:贴壁细胞去除培养基后直接加trizol,团块和悬浮细胞在收集到细胞后加适量Trizol重悬(10^6细胞之内加1mlTrizol)。所有细胞样本在加入裂解液后需要用移液器吹打至无明显细胞残渣。
4.组织收集:取材应在冰上进行,取材后组织用生理盐水冲洗干净,去除血渍和污物,并剔除非研究所需的组织。取动物的组织,动作要求迅速,尽量避免样本在环境中暴露太久。
5.运输:使用大体积干冰运输;
6.取样量:细胞10^6以上,组织:50mg