一、涂片制备（关键前置步骤）
自备多聚赖氨酸包被的载玻片。
涂菌
固体菌落：接种环灼烧冷却，取一小点菌落，滴1滴无菌水在玻片上，均匀涂开成薄菌膜（直径约1cm）。
菌液样本：接种环取一环菌液，直接涂布成薄层。
要点：薄！太厚极易脱色失败，假阳性
自然干燥：室温平放自然风干；可远离酒精灯微加热助干，严禁直接灼烧烤干，菌体变形。
火焰固定：玻片涂面朝上，快速穿过酒精灯外焰2～3次（手背摸玻片背面微烫即可），冷却。
作用：杀死细菌、蛋白凝固，菌体粘附玻片，染色不脱落
二、革兰染色4步（核心）
染液顺序：结晶紫 → 碘液 → 95%乙醇脱色 → 番红（沙黄）复染
初染（结晶紫）：滴结晶紫完全覆盖菌膜，1 min；斜置玻片，细水流缓慢冲洗玻片边缘，洗去浮色，沥干。全部细菌此时均为紫色；
媒染（卢戈碘液）：滴碘液覆盖，1 min；水洗，沥干。碘与结晶紫形成大分子复合物，锁在G+厚肽聚糖内 ；
脱色（95%乙醇，最关键一步！）：逐滴滴加乙醇，倾斜玻片，观察流出乙醇无紫色即可，一般5～30 s；立刻水洗终止脱色。
G+：厚肽聚糖脱水收缩，锁住紫色复合物 → 紫色
G-：外膜脂质被酒精溶解，肽聚糖薄，紫色复合物流出 → 无色
❌脱色不足：G-也紫色（假阳性）；脱色太久：G+褪成无色（假阴性），涂片越厚脱色时间越长
复染（番红/沙黄）：滴番红染液覆盖，30 s～1 min；水洗。
G+：依旧紫色；G-：被番红染成粉红色/红色
三、镜检前处理
吸水纸轻压吸干水分（不要来回擦，擦掉细菌），油镜观察。
✅结果判读：
革兰阳性G⁺：紫色（如金黄色葡萄球菌）
革兰阴性G⁻：粉红色/红色（大肠杆菌）
来源:http://www.sxyksw.com/news1096834.html