一、实验前准备
试剂配制
1.0.01M PBS（pH7.4）：室温/37℃预热，用量20mL/只
2.4%多聚甲醛（PFA）：PBS配制，4℃预冷，用量20mL/只
3.麻醉剂：1%戊巴比妥钠，现配现用
器械准备
眼科剪、眼科镊、止血钳、22-25G磨钝针头、50mL注射器、解剖板、碘伏、医用棉球
二、实验操作步骤
1.小鼠麻醉：1%戊巴比妥钠腹腔注射，剂量40-60mg/kg，待角膜反射消失、肌肉松弛，确认麻醉成功
2.固定消毒：小鼠仰卧固定于解剖板，胸部皮肤碘伏消毒
3.暴露心脏：剑突下剪开皮肤，分离胸肌，沿肋骨剪开胸骨，充分暴露心脏
4.穿刺固定：左手固定心脏，右手持磨钝针头从左心室心尖斜向头端刺入，止血钳固定针头
5.排血冲洗：剪开右心耳放血，缓慢推注PBS，直至右心耳流出液清亮、肝脏完全变白
6.组织固定：换预冷4%PFA缓慢灌注，直至小鼠四肢僵硬、躯干紧绷，停止灌注
7.取材后固定：快速断头剥离全脑，放入4%PFA，4℃后固定24-48h，备用
三、关键操作参数
•灌注速度：PBS 5-10mL/min，4%PFA 3-5mL/min
•灌注总量：每只小鼠PBS、PFA各15-20mL
•针头要求：必须磨钝，避免刺破心室壁
四、注意事项&故障排除
1.灌注前注射器、针头彻底排尽气泡，避免空气栓塞
2.针头误入右心室：立即退针，重新穿刺左心室
3.流出液持续发红：检查针头位置、扩大右心耳开口，补足PBS灌注量
4.全程动作轻柔，避免牵拉心脏导致灌注失败
5.4%PFA具有刺激性，操作时做好防护
